Et fluorescensfilter er en væsentlig komponent i fluorescensmikroskop. Et typisk system har tre grundlæggende filtre: et excitationsfilter, et emissionsfilter og et dikroisk spejl. De er almindeligvis pakket i en terning, så gruppen indsættes sammen i mikroskopet.
Hvordan virker et fluorescensfilter?
Excitationsfilter
Excitationsfiltre transmitterer lys af en bestemt bølgelængde og blokerer andre bølgelængder. De kan bruges til at producere forskellige farver ved at indstille filteret til kun at tillade én farve igennem. Excitationsfiltrene findes i to hovedtyper - langpasfiltre og båndpasfiltre. Exciteren er sædvanligvis et båndpasfilter, der kun passerer de bølgelængder, der absorberes af fluoroforen, og dermed minimerer excitation af andre fluorescenskilder og blokerer excitationslys i fluorescensemissionsbåndet. Som vist med den blå linje i figuren er BP 460-495, hvilket betyder, at det kun kan passere gennem fluorescensen på 460-495nm.
Det er placeret inden for belysningsvejen af et fluorescensmikroskop og filtrerer alle bølgelængder af lyskilden ud, bortset fra fluorofor-excitationsområdet. Filterets minimumstransmission dikterer billedernes lysstyrke og glans. Et minimum på 40% transmission for ethvert excitationsfilter anbefales, således at transmissionen ideelt set er >85%. Båndbredden af excitationsfilteret bør være helt inden for fluorophorexcitationsområdet, således at filtrets centerbølgelængde (CWL) er så tæt som muligt på fluoroforens maksimale excitationsbølgelængde. Excitationsfilterets optiske densitet (OD) dikterer baggrundsbilledets mørke; OD er et mål for, hvor godt et filter blokerer bølgelængderne uden for transmissionsområde eller båndbredde. En minimum OD på 3,0 anbefales, men en OD på 6,0 eller derover er ideel.
Emissionsfilter
Emissionsfiltre tjener det formål at tillade den ønskede fluorescens fra prøven at nå detektoren. De blokerer kortere bølgelængder og har høj transmission for længere bølgelængder. Filtertypen er også forbundet med et tal, f.eks. BA510IF i figuren (interferensbarrierefilter), denne betegnelse refererer til bølgelængden ved 50 % af dens maksimale transmission.
De samme anbefalinger for excitationsfiltre gælder for emissionsfiltre: minimum transmission, båndbredde, OD og CWL. Et emissionsfilter med den ideelle CWL, minimum transmission og OD kombination giver de lysest mulige billeder, med den dybeste mulige blokering og sikrer detektering af de svageste emissionssignaler.
Dichroisk spejl
Det dikroiske spejl er placeret mellem excitationsfilteret og emissionsfilteret i en 45° vinkel og reflekterer excitationssignalet mod fluoroforen, mens det transmitterer emissionssignalet mod detektoren. Ideelle dikroiske filtre og stråledelere har skarpe overgange mellem maksimal refleksion og maksimal transmission, med en >95% refleksion for excitationsfilterets båndbredde og en transmission på >90% for emissionsfilterets båndbredde. Vælg filteret med fluoroforens skæringsbølgelængde (λ) i tankerne for at minimere strølys og maksimere det fluorescerende billedes signal-til-støj-forhold.
Det dikroiske spejl i denne figur er DM505, så navngivet, fordi 505 nanometer er bølgelængden ved 50 % af den maksimale transmission for dette spejl. Transmissionskurven for dette spejl viser høj transmission over 505 nm, et stejlt fald i transmissionen til venstre for 505 nanometer og maksimal reflektivitet til venstre for 505 nanometer, men kan stadig have en vis transmission under 505 nm.
Hvad er forskellen mellem langpas- og båndpasfiltre?
Fluorescensfiltre kan opdeles i to typer: langpas (LP) og båndpas (BP).
Langpasfiltre transmitterer lange bølgelængder og blokerer de kortere. Cut-on bølgelængden er værdien ved 50% af peak transmission, og alle bølgelængder over cut-on transmitteres af langpasfiltrene. De bruges ofte i dikroiske spejle og emissionsfiltre. Langpasfiltre bør anvendes, når applikationen kræver maksimal emissionsopsamling, og når spektral diskrimination ikke er ønskelig eller nødvendig, hvilket generelt er tilfældet for prober, der genererer en enkelt emitterende art i prøver med relativt lave niveauer af baggrundsautofluorescens.
Båndpasfiltre transmitterer kun et bestemt bølgelængdebånd og blokerer andre. De reducerer krydstale ved at tillade kun den stærkeste del af fluoroforemissionsspektret at blive transmitteret, reducerer autofluorescensstøj og forbedrer dermed signal-til-støjforholdet i højbaggrundsautofluorescensprøver, som langpasfiltre ikke kan tilbyde.
Hvor mange typer fluorescensfiltersæt kan BestScope levere?
Nogle almindelige typer filtre omfatter blå, grønne og ultraviolette filtre. Som vist i tabellen.
| Filtersæt | Excitationsfilter | Dichroisk spejl | Barriere filter | LED-lampe Bølgelængde | Anvendelse |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Fluorescerende antistofmetode ·Acidin orange: DNA, RNA ·Auramin: Tuberkelbacille ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluorescerende antistofmetode ·Propidiumiodid: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Auto-fluorescensobservation ·DAPI: DNA-farvning · Hoechest 332528, 33342: bruges til kromosomfarvning |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Katekolaminer ·5-hydroxytryptamin ·Tetracyklin: Skelet, tænder |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Filtersæt, der bruges til fluorescensoptagelser, er designet omkring de vigtigste bølgelængder, der bruges i fluorescensapplikationer, som er baseret på de mest anvendte fluoroforer. Af denne grund er de også opkaldt efter den fluorofor, de er beregnet til billeddannelse, såsom DAPI (blå), FITC (grøn) eller TRITC (rød) filterterninger.
| Filtersæt | Excitationsfilter | Dichroisk spejl | Barriere filter | LED-lampe Bølgelængde |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas rød | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Hvordan vælger du et fluorescensfilter?
1. Princippet for valg af fluorescensfilter er at lade fluorescens/emissionslyset passere gennem billeddannelsesenden så langt som muligt og fuldstændigt blokere excitationslyset på samme tid, for at opnå det højeste signal-til-støj-forhold. Især for anvendelsen af multifoton-excitation og total intern reflektionsmikroskop vil den svage støj også forårsage stor interferens på billedeffekten, så kravet til signal til støjforhold er højere.
2. Kend fluoroforens excitations- og emissionsspektrum. For at konstruere et fluorescensfiltersæt, der genererer et højkvalitets-, højkontrastbillede med en sort baggrund, bør excitations- og emissionsfiltre opnå høj transmission med minimal passbånd-rippel over de områder, der svarer til fluorofor-excitationstoppene eller -emissionerne.
3. Overvej holdbarheden af fluorescensfiltre. Disse filtre skal være uigennemtrængelige for intense lyskilder, der genererer ultraviolet (UV) lys, der kan føre til "udbrænding", især af exciter-filteret, da det udsættes for belysningskildens fulde intensitet.
De forskellige fluorescerende prøvebilleder
Ressourcerne indsamles og organiseres på internettet, og bruges kun til læring og kommunikation. Hvis der er nogen overtrædelse, bedes du kontakte os for at slette.
Posttid: Dec-09-2022